Reacción en cadena de la polimerasa

1

Introducción

Reacción en cadena de la polimerasa (RCP), técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. La RCP puede utilizarse para identificar individuos a partir de cantidades mínimas de tejidos o sangre, para diagnosticar enfermedades genéticas y para investigar la evolución.

La RCP fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo.

La RCP opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento en unas pocas horas. La técnica es sencilla y pueden utilizarla científicos sin demasiada formación en biología molecular. Los elementos necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de juego, y se utilizan en medios muy variados, desde la investigación forense hasta el diagnóstico clínico.

2

Funcionamiento de la RCP

La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación o reproducción del ADN que ocurre de forma natural en las células vivas. La mayor parte del ADN es de doble cadena (es decir, cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria). Durante la replicación las dos cadenas se separan y una enzima (una proteína que inicia reacciones químicas) especializada llamada polimerasa hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas hijas por cada una de las cadenas parentales (véase Genética).

La polimerasa necesita otros dos ingredientes para copiar ADN. El primero es una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN, llamados nucleótidos o bases. El segundo es una fibra corta de ADN copiado, que se llama cebador oligonucleotídico; está formado por varios nucleótidos que inician la replicación. La RCP utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN en una ampolla.

La reacción tiene lugar en tres fases. Durante la primera o desnaturalización la plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90º a 95 ºC durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas. En la segunda fase, llamada templado, la temperatura de la mezcla se rebaja hasta 55 ºC durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se enlacen con el ADN escindido. En la tercera fase o de polimerización, la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75 °C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN.

Estas tres fases tienen lugar en la misma ampolla y constituyen un ciclo completo de RCP, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de RCP se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN.

La polimerasa utilizada en los primeros experimentos de RCP resultaba fácilmente destruida por el calor, lo que obligaba a añadir más enzima en cada ciclo para sustituir a la inactivada por las elevadas temperaturas de la primera fase. Pero en las versiones modernas de la RCP se utiliza una polimerasa termoestable llamada Taq. Inicialmente se extraía de Thermus aquaticus, una bacteria termófila que vive en los manantiales de agua caliente del Parque nacional de Yellowstone (Estados Unidos). Como la polimerasa Taq no resulta destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la RCP, basta con añadirla una vez, al principio de la reacción. La polimerasa Taq se fabrica ahora con bacterias modificadas genéticamente.

El uso de la RCP exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar la contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente cantidades mínimas de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación.

3

Aplicaciones

Como bastan pequeñas cantidades de muestras de ADN relativamente poco refinadas, la RCP se ha convertido en un valioso instrumento de investigación en biología y medicina clínica y forense (aplicación del conocimiento científico al trabajo de investigación policial).

En la investigación biológica la RCP ha acelerado el estudio de la función de los genes, la cartografía genética y la evolución. En la investigación de la función de los genes se utiliza la RCP para obtener copias de genes individuales, cuyas actividades pueden estudiarse y definirse con mayor precisión. La cartografía genética (véase Proyecto Genoma Humano) recurre a la RCP para obtener copias múltiples de regiones determinadas del ADN humano. Estas regiones pueden examinarse a continuación para comprobar si están vinculadas con enfermedades genéticas, como la fibrosis quística.

También se ha beneficiado de la RCP el estudio de la evolución. Los científicos la han utilizado para estudiar el ADN de insectos atrapados hace miles de años en gotas de ámbar. Aun cuando gran parte de ese ADN ha perdido su estructura, se conserva todavía intacta una cantidad suficiente para ser multiplicada mediante la RCP para comparar el resultado con el observado en insectos actuales.

En medicina, la RCP resulta particularmente útil en el diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas. Las muestras de ADN obtenidas del feto mediante amniocentesis (extracción de una pequeña cantidad de líquido del útero materno) se analizan ahora en sólo unas horas. Antes era necesario cultivar células fetales en un medio nutritivo especial durante varias semanas para poder realizar análisis bioquímicos. La RCP también se ha utilizado en células tomadas de embriones de sólo unas horas de edad fertilizados in vitro (en un tubo de ensayo) para determinar si están exentos de enfermedades. A continuación, el embrión se implanta en el útero materno para iniciar un embarazo normal.

Otras aplicaciones médicas de la RCP son la identificación de virus, bacterias y células cancerosas en tejidos humanos. Puede utilizarse incluso con células individuales aplicando una variante llamada RCP in situ para identificar tipos celulares específicos.

En medicina forense la RCP ha revolucionado la identificación de delincuentes. Las pruebas de tipificación de ADN basadas en RCP pueden crear ‘huellas dactilares’ (véase Pruebas de ADN) que identifican sin ambigüedad a cualquier persona. Estas pruebas permiten también excluir o implicar a sospechosos basándose en pequeñas cantidades de sangre, piel, pelo o semen recogidas en el escenario del delito.

La RCP se ha utilizado para seguir la pista a residuos industriales y otros productos. Se añaden en origen pequeñas cantidades de ADN de un tipo conocido a lotes de explosivos, derivados del petróleo, venenos, y otros residuos, que quedan así definitivamente etiquetados. Estas etiquetas de ADN pueden recuperarse a partir de fangos u otros contaminantes recogidos en vías de agua públicas (véase Contaminación del agua), por ejemplo, y multiplicarse mediante RCP para comparar el resultado con las listas que mantienen los fabricantes de las etiquetas. Una coincidencia es una prueba con mucho peso que puede inculpar al responsable de la contaminación.